Наборы для выделения плазмидной ДНК (минипреп)

Набор предназначен для быстрого и качественного выделения плазмидной ДНК из клеток E.coli (минипреп). Плазмидная ДНК избирательно сорбируются на фильтре спин-колонки. Геномная ДНК, белки, соли и нуклеотиды вымываются этанол-содержащим буфером. Плазмидная ДНК элюируются низкосолевым буфером.  На одной колонке возможно выделение до 25 микро-граммов плазмидной ДНК из 1-10 мл культуры клеток E.coli.

Формат
Кат. номер
Цена, руб.
50 минипреповB0012 700
250 минипреповB00211 500

Свойства:

  • Сорбция/элюция плазмидной ДНК осуществляется на фильтрах спин-колонок
  • Более 700 оснований прочитывается с выделенной ДНК как стандарт
  • Выделение высоко- и низкокопийных плазмид для секвенирования, клонирования, трансформации и других ферментативных манипуляций
  • Емкость колонок по ДНК до 25 микро-граммов
  • 12 образцов за 20 минут
  • Объем элюирующего буфера 10-50 микро-литров

 Реагенты и оборудование, необходимые для работы:

  • Настольная центрифуга для микро-пробирок (1.5-2.0мл), 7000-12000 об/мин
  • Этанол, 96%
  • Автоматическая пипетка или дозатор

 Руководство к пользованию:

Набор предназначен для очистки плазмидной ДНК из культуры E.coli объемом 1-2 мл (высококопийные плазмиды) или до 10 мл (низкокопийные плазмиды).

Состав Набора:

Компонент:
В001
В002
Спин-колонки50250
2-мл пробирки для сбора элюата50250
1.5-мл пробирки без крышек для элюции ДНК50250
РНКаза А, 5мг/мл0.3 мл1.5 мл
Раствор I, для ресуспендирования клеток12 мл60 мл
Раствор II, лизирующий12 мл60 мл
Раствор III, нейтрализующий24 мл120 мл
Раствор для промывки, конц.17.5 мл87.5 мл
Буфер для элюции ДНК5 мл25 мл

Перед началом эксперимента:

1. Добавьте РНКазу А к Раствору I, после этого храните раствор при +4 °С.

2. Раствор II может образовывать осадок, растворите его прогреванием при +37-50 °C.

3. Добавьте 2.3 объема этанола (96-100%) к 1 объему концентрата буфера для промывки, например 41 мл этанола к 17.5 мл буфера.

4. TE буфер не рекомендуется для элюции ДНК.

5. Для всех процедур подойдет настольная центрифуга любого типа (7,000-12,000 об/мин).

6. Оптимальный объем культуры клеток для выделения плазмидной ДНК – 2 мл. При работе с большими объемами увеличивайте время инкубирования с раствором 1 до 5 мин.

7. Все операции происходят при комнатной температуре.

Протокол:

 1. Осадите клетки центифугированием в 1.5 или 2.0 мл пробирке в течение 15 с. Полностью удалите супернатант.

2. Добавьте 150 мкл Раствора I и ресуспендируйте осадок. Инкубируйте при комнотной температуре 1 мин.

3. Добавьте 150 мкл Раствора II, перемешайте осторожным переворачиванием пробирки (3-7 раз). Не взбалтывать! Смесь осветляется – происходит лизис клеток. Если растворы перемашаны быстрым добавлением Раствора II, то дальнейшее переворачиване не нужно. Немедленно переходите к следующей стадии, не инкубируйте более чем 1 мин.

4. Быстро добавьте 300 мкл Раствора III и сразу перемешайте переворачиванием или энергичным встряхиванием. Инкубируйте 1 мин.

5. Центрифугируйте в течение 7-10 мин.

6. Перенесите супернатант в спин-колонку, центрифугируйте в течение 15 с.

7. Удалите элюат и нанесите на спин-колонку 500 мкл раствора для промывки (этанол добавлен!). Центрифугируйте 15 с.

8. Повторите шаг 7.

9. Удалите элюат. Центрифугируйте еще 1 мин чтобы удалить остатки промывочного раствора и подсушить мембрану.

10. Перенесите спин-колонку в пробирку для элюции. Добавьте 50 мкл Буфера для элюции в центральную часть мембраны спин-колонки и инкубируйте 2 мин. Центрифугируйте 1 мин. Для более полной элюции плазмидной ДНК используйте Буфер для элюции ДНК подогретый до 37-60°C.

11. Перенесите ДНК в новую прибирку и храните при –20 °С.

Возможные проблемы:

Следы РНК в препарате ДНКНеполный гидролиз РНК. Увеличьте время инкубации клеток с РНКазой.
Низкий выход плазмидной ДНКА) Недостаточный лизис клеток – пропорционально увеличьте объемы растворов I, II и III.

Б) Увеличьте время инкубации с Буфером для элюции до 5 мин. Добавляйте буфер в самый центр колонки. Используйте буфер подогретый до 60 °C. Центрифугируйте при меньшей скорости 4,000-5,000 об/мин.

Рис1 : Плазмидная ДНК выделенная и очищенная с помощью Набора из 2 мл ночной культуры E.coli (5 мкл/линию). ДНК была элюирована в 50 мкл буфера.

Маркер — Q-Step 4 DNA ladder (Cat# M4042).

plasmidpurification

 

Рис 2: Электрофореграмма плазмидной ДНК секвенированной после очистки                               с помощью ALMA-mini:

Электрофореграмма

Яндекс.Метрика