Иммунизация, очистка и хранение поликлональных антител

Типичная схема иммунизации:
День 1: Взятие преиммунной сыворотки, ELISA. Первая иммунизация антигеном с полным адъювантом Фрейнда внутрикожно;
День 28:Первая бустерная иммунизация антигеном с неполным адъювантом Фрейнда внутрикожно;
День 42: Вторая бустерная иммунизация;
День 52: Первое взятие крови 50мл от одного кролика. Третья бустерная иммунизация;
День 62: Второе взятие крови 50мл, определение титра (ELISA), осаждение фракции иммуноглобулинов насыщенным раствором сульфата аммония до конечной концентрации сульфата — 33%.

Протокол выделения антител: сыворотка полученная от разных животных обрабатывается отдельно. Сыворотка крови отделяется центрифугированием, помещается в стакан. Насыщенный раствор сульфата аммония (рН7.0) добавляется по каплям в течение 6 часов при +4˚С до конечной концентрации сульфата – 33%. Суспензию центрифугируют и осадок промывают дважды свежим раствором сульфата аммония с концентрацией 33%. Конечный осадок ресуспендируют в 2-4 мл этого же раствора.

Хранение: суспензия иммуноглобулинов в сульфате аммония хранится при +4˚С неопределенно долгое время. Не замораживать! Растворенные в буфере антитела можно хранить в течение нескольких недель при +4˚С. Если в буфер добавить глицерин до 50% по массе, то препарат можно хранить замороженным при -20 — 70˚С в течение нескольких лет. Преиммунную сыворотку можно разделить на мелкие аликвоты и хранить при -70˚С или при +4˚С в течение нескольких недель если к ней добавить антибактериальный агент, например тимерозал, до 0.02%.

Как выделить антитела из суспензии осадка после осаждения сульфатом аммония: центрифугировать необходимый объем суспензии (>8000g, 10-15 мин), растворить осадок в двух или более объемах буфера, например PBS. Осветлить раствор центрифугированием. Антитела готовы к работе. При необходимости препарат антител можно обессолить на колонке с сефадексом или диализом. Можно также добавить к препарату глицерин до 50% для хранения при -20 — 70˚С.

Титр: Минимальный титр определяется в эксперименте с применением метода прямой ELISA. Титр определен как разбавление раствора антител достаточное для изменения оптической плотности на 1.0 при 450нм в реакции превращения субстрата в течение 20 мин при 25˚С. Лунки планшета покрываются антигеном с концентрацией 5мкг/мл в 50мМ бикарбонатном буфере, рН9.6. Цветной реагент – 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (TMB).

Яндекс.Метрика