ALMA-mini-96: Набор для выделения плазмидной ДНК (минипреп) в 96-луночном планшете

ALMA-mini-96 является простым, быстрым и экономичным набором для выделения плазмидной ДНК из культуры E.coli и других бактерий. Плазмидная ДНК избирательно сорбируются на фильтре спин-колонки. Геномная ДНК, белки, соли и нуклеотиды вымываются этанол-содержащим буфером. Плазмидная ДНК элюируются низкосолевым буфером.  На одной колонке возможно выделение до 25 микро-граммов плазмидной ДНК из 1-10 мл культуры клеток E.coli.

Формат
Кат.  номер
Цена, руб.
2 x 96 минипреповB0033 800
10 x 96 минипреповB00416 000

Свойства:

· Высокопроизводительная процедура выделения ДНК
· Процесс выделения занимает 60 минут
· 96-луночный формат
· Сорбция/элюция плазмидной ДНК осуществляется на микро-фильтрах планшета
· Более 700 оснований прочитывается с выделенной ДНК как стандарт
· Выделение высоко- и низкокопийных плазмид для секвенирования, клонирования, трансформации и других ферментативных манипуляций
· Объем элюирующего буфера 10-50 микро-литров
· Выход >80%, около 10 мкг (pUC18) c 1.3 мл ночной культуры

Реагенты и оборудование, необходимые для работы:

· Центрифуга с вкладышами к ротору для 96-луночных планшетов. Высота конструкции из двух планшетов (с фильтрами и для сбора элюата) – 750мм.
· Этанол, 96%
· Автоматическая пипетка или дозатор, 8-ми или 12-ти канальные пипетки


Руководство к пользованию:

Набор предназначен для очистки плазмидной ДНК из культуры E.coli объемом 1.3 мл

Состав Набора:

Компонент:
 B003
B004 
96-луночный планшет с фильтрами, синие210
96-луночный планшет с колонками, красные210
96-луночный планшет для роста бактерий и сбора элюата630
96-луночный планшет для элюции и хранения ДНК210
Пленка для заклеивания планшетов1050
РНКаза А, 5мг/мл3 мл15 мл
Раствор I, для ресуспендирования клеток30 мл150 мл
Раствор II, лизирующий30 мл150 мл
Раствор III, нейтрализующий60 мл300 мл
Раствор для промывки, конц.35 мл175 мл
Буфер для элюции ДНК10 мл25 мл

Перед началом эксперимента:

· Добавьте РНКазу А к Раствору I, после этого храните раствор при +4 °С.
· Раствор II может образовывать осадок, растворите его прогреванием при +37-50 °C.
· Добавьте 2.3 объема этанола (96-100%) к 1 объему концентрата буфера для промывки, например 82 мл этанола к 35 мл концентрата буфера.
· TE буфер не рекомендуется для элюции ДНК
· Все операции происходят при комнатной температуре.

Протокол:

1. Налить в каждую лунку 96-луночного планшета 1.3 мл среды для выращивания бактерий с соответствующим антибиотиком. Инокулировать колониями бактерий. Закрыть слоем ваты или другим материалом пропускающим воздух. Инкубировать 20-24 часа при 37ºС на качалке при 300 об/мин.

2. Заклейте планшет липкой пленкой и осадите клетки центифугированием 5 мин при 1500 об/мин. Полностью удалите супернатант переворачиванием планшета. Примечание: чтобы удалить супернатант, осторожно снимите липкую пленку с планшета, быстро переверните планшет над контейнером для отработанной среды, прижмите перевернутый планшет к салфетке (бумажному полотенцу) чтобы удалить остаточные капли среды.

3. Добавьте в каждую лунку 150 мкл Раствора I, заклейте пленкой, ресуспендируйте клетки на вортексе и инкубируйте 3 мин при комнатной температуре. Проверьте что Рнказа добавлена в Раствор I. Клетки должны быть ресуспендированы полностью, комки клеток уменьшат выход плазмиды.

4. В каждую лунку добавьте по150 мкл Раствора II, заклейте планшет пленкой и перемешайте осторожным переворачиванием 10 раз, инкубировать 2 мин. Не взбалтывать! Смесь осветляется – происходит лизис клеток. Если растворы перемашаны быстрым добавлением Раствора II, то дальнейшее переворачиване не нужно. Немедленно переходите к следующей стадии, не инкубируйте более чем 1 мин.

5. Быстро добавьте 300 мкл Раствора III, заклейте пленкой и сразу перемешайте переворачиванием или энергичным встряхиванием (10 раз). Инкубируйте 1 мин.

6.Центрифугируйте в течение 15-20 мин при 8,000 об/мин.

7. Удалите пленку и перенесите супернатант в 96-луночный планшет с фильтрами (синие), укрепите снизу планшет для сбора элюата и центрифугируйте в течение 5 мин при 3,000 об/мин.

8. Перенесите супернатант (элюат – осветленный лизат) в 96-луночный планшет с колонками (красные) 8-канальной пипеткой, сентрифугируйте 5 мин при 3,000 об/мин.

9. Выбросить элюат и добавить 500 мкл Раствора для промывки (этанол добавлен!). Центрифугировать 5 мин при 6,000 об/мин.

10.Повторите шаг 9.

11. Удалите элюат. Центрифугируйте еще 5 мин при 6,000 об/мин чтобы удалить остатки промывочного раствора и подсушить мембраны.

12. Поместить 96-луночный планшет с колонками на планшет для элюции и хранения ДНК. Добавьте 30-50 мкл Буфера для элюции в центральную (важно!) часть мембран планшета и инкубируйте 2 мин при 37-50ºС. Центрифугируйте 5 мин при 6,000 об/мин. Для более полной элюции плазмидной ДНК используйте Буфер для элюции ДНК подогретый до 37-60 °C.

13. Плазмидная ДНК готова для использования или хранения при –20 °С.

 

Возможные проблемы:

Следы РНК в препарате ДНК
Неполный гидролиз РНК. Увеличьте время инкубации клеток с РНКазой.
Низкий выход плазмидной ДНКА) Недостаточный лизис клеток – пропорционально увеличьте объемы растворов I, II и III.
Б) Увеличьте время инкубации с Буфером для элюции до 5 мин. Добавляйте буфер в самый центр колонки.  Используйте буфер подогретый до 60 °C.

Яндекс.Метрика